15%尿素-PAGE制胶液（DNA，microRNA） RY0470

操作步骤(仅供参考)： 

1. 边摇晃溶液变加入TEMED 和10%过硫酸铵。

2. 再充分摇晃约30秒后迅速灌胶，然后插入样品梳，室温放置30-60分钟等待胶凝固。

3. 将凝胶板放置在电泳装置上后，在上下层分别加入适当量的1×TBE电泳缓冲液。如果不马上使用，需要用湿纸将上样孔端盖住以防凝胶过度干燥。 

4. 拔出梳子后用加样枪吸取电泳缓冲液，充分将每个加样孔中未聚合的 Acrylamide/Bis、尿素和气泡吹打出来。

5. 在上样前，预电泳20-30分钟以使多余的过硫酸铵跑出加样孔，同时还可以使凝胶的温度升高（到50℃左右），有利于RNA变性状态。 

6. 将miRNA样品与等体积的miRNAon混合，70℃保温2-3分钟后迅速放置在冰上冷却，快速离心半分钟，放冰上待用。miRNA Marker需要每个上样孔用5uL，一块胶最好在两侧各用一个孔上样miRNA Marker。 

7. 关电泳仪后开始上样。 

8. 重开电泳仪，对13cm×15cm的胶，以20-30mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止；对36cm×45cm 的胶，则以50-60mA的电流电泳，直到红色染料移动到凝胶边缘为止。 

9. 染色观察：将凝胶一面的玻璃板揭开，直接用仍然附着在另一玻璃板上的凝胶进行各种染色，包括银染（固定、漂洗、显影和定影等步骤）、EB（每 100 mL 1×TBE 中加 20 uL 10mg/mL 的 EB 溶液）。UV 下观察并拍照。 

10. miRNA回收：按上法用 EB 等染料染色后，UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后进行胶回收处理。 

11. Northern杂交：按上法用 EB 等染料染色后，UV下确定所需要的miRNA条带的位置，切胶后电转移到带正电的尼龙膜上，然后进行杂交处理。 

12. 放射自显影：如果miRNA样品电泳前经过同位素标记，则将凝胶一面的玻璃板揭开，用滤纸将附着在另一玻璃板上的凝胶吸附过来，然后包上保鲜膜，真空抽干，然后使胶跟X光片向对进行放射自显影。 

注意事项：为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

注：Acr/Bis的终浓度需要根据待分离RNA长度选择（见下表）

6-100 nt             20%

25-150 nt           15%

40-200 nt           12%

60-400 nt            8%

80-500 nt            5%

1000-2000 nt      3.50%

备注：以上数据均来自公开文献, 仅供参考