增强型 ECL超敏发光液 RY0488

ECL化学发光试剂盒能够被辣根过氧化物酶（HRP）催化发光。本试剂盒优化了底物组成，使用了新型高效增强剂，发光强度比传统 ECL显色液提高了30-100倍，并有效地降低了背景。试剂盒使用新的氧化剂代替不稳定的双氧水，提高了试剂盒的稳定性，室温可稳定放置1年。工作液被 HRP 催化后，发出特定波长荧光（400-450 nm），可对X光胶片曝光，也可直接使用荧光CCD扫描，主要应用于Western 检测以及化学发光免疫检测系统。

储存条件: 4℃，密封，避光

使用说明：

一、缓冲液的配置：

1、一抗工作浓度：0.2-1.0 µg/mL；

2、HRP 标记二抗工作浓度：10-500 ng/mL，根据二抗效价调整。

3、显色液的使用比例：A液: B液 = 1:1（现用现配）；10 cm2转印膜使用1-2 mL工作液。

二、操作步骤：

1、根据常规操作转印结束后，进行封闭、一抗孵育、二抗孵育以及必要的洗膜步骤，根据膜的大小，按每 250px2膜使用1-2mL工作液，按比例吸取等体积溶液A和溶液B混匀，配制成发光检测工作液。

2、用平头镊子将膜取出，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体。用移液器将工作液加到转印膜上，使其均匀覆盖，室温孵育 1-2 分钟，此步骤可在洁净保鲜膜上或塑料盒中完成。

3、X 光胶片法

a)        用平头镊子夹起转印膜，膜的下缘轻轻接触吸水纸，去除膜上多余的液体，留下少量工作液，不要让膜完全干燥。膜的蛋白面朝上，包裹于洁净保鲜膜内。轻轻赶出其间的气泡用小块透明胶带粘住四角，固定在 X 光片暗盒内。

b)        在暗室中取一张X光胶片置于包裹的膜上，合上暗盒，曝光30秒至1分钟。立即显影、定影，根据曝光强度，调整下一张X光胶片的曝光时间。如果背景过高，可以使用两张X光胶片同时压片。

4、荧光拍照法：

a)        如果需要使用 CCD 拍照，可以将膜放置于工作液中，开机后按照使用说明，将转印膜取出，进行拍照。

b)        可以根据背景情况，调整机器测量参数，提高信噪比。

5、管式化学发光法：

a)        将ECL的化学发光检测波长可设定在 425nm 左右，可以选择单点测量，或者取多次平均值。

b)        按照机器要求，将配制好的工作液加入到样品管中，间隔一定时间测量发光强度，注

c)        意ECL系统的发光到达峰值有一定延迟（30-300 秒），不同样本的测量时间间隔要固定。

d)       HRP 催化ECL发光的体系还受到反应温度以及 pH 的强烈影响，所以工作试剂准备以及发光测量需要考虑到此类因素。

注意事项：

1、试剂盒溶液A为底物，保存于避光试剂瓶中，溶液B为氧化剂。通常取样顺序是先取底物 溶液A，换枪头后再取氧化剂溶液B。

2、本试剂盒较为稳定，室温（25℃）可以保存一年以上，长期不用建议保存在 2-8℃。

3、使用生物素-亲和素系统时，避免使用牛奶封闭，可能会造成背景过高。

4、金属氧化物颗粒可能会造成膜上出现颗粒状斑点，避免使用带有锈迹的剪刀以及镊子，可以使用平头塑料镊子。

5、叠氮化钠抑制 HRP 的催化能力，在缓冲液中尽量避免使用叠氮化钠作为防腐剂。

6、封闭、洗膜、孵育等步骤耗时较长，注意膜与塑料界面的摩擦不均匀可能造成部分位置条带消失，可以在保鲜膜中孵育以及封闭，洗膜的塑料盒底面不要有明显凸起，可以通过剪角的方法，区别转印膜有蛋白的一面。

7、不同转印膜对蛋白的吸附能力不同，硝酸纤维素较软，避免出现折痕。PVDF膜使用前需要使用甲醇水化均匀。

8、勿将多张膜置于同一个洗膜盒中洗膜，相互吸附以及摩擦可能造成很深的背景。

9、转印、封闭、孵育都要避免气泡。

A and Q

Q： 胶片无条带显现或者信号较弱

A1：转膜的效率低 --用预染色分子量标准来判断，提高转膜效率

A2：抗原/抗体量少或不匹配 --增加抗原/抗体量或选择合适抗原/抗体

A3： X光胶片有问题 --X光片洗片以后应当为透明的胶片，如果全黑则说明已经完全曝光了，应当废弃

A4：定显影液有问题 --可以先曝光一张胶片来验证，若有问题及时更换新的定显影液

A5：反应系统中HRP量过多 --稀释HRP标记物

Q： X光胶片背景脏

A1：一抗、二抗浓度太高 --降低抗体浓度，延长封闭时间

A2：抗体未清洗干净 --增加洗膜次数

Q： 条带有空斑

A： 抗原以及二抗的浓度过高 --稀释样品重新跑胶，也可以将混合好的显色液冰浴后，加入到膜上，立即快速显色

Q：带型不规则

A：转膜时有气泡也有可能是转印膜没有水化均匀 --转膜时尽量优化条件

备注：以上数据均来自公开文献, 仅供参考