非洲猪瘟病毒检测试剂盒（荧光定量PCR法）

非洲猪瘟病毒检测试剂盒（荧光定量PCR法）

（仅供科研使用）

1. 【产品名称】

      通用名称：非洲猪瘟病毒检测试剂盒（荧光定量PCR法）

2. 【预期用途】  

本产品用于血清、血浆、口鼻拭子、组织样（脾、肺、淋巴结等）、环境样等样本中定性检测病毒核酸。

3. 【检测原理】  

本试剂盒以非洲猪瘟病毒基因组的相对保守区作为检测靶区域，设计特异性引物和特异Taqman探针，保证试剂盒的检测灵敏度和精确度。在PCR反应体系中引入UNG酶+dUTP措施，有效的降解扩增产物气溶胶污染，避免假阳性。

4. 【产品组成】  50 T/盒

5. 【适用仪器】  

核酸扩增仪：TL Gentier 96E、TL Gentier 48E、杭州博日FQD-96A、上海宏石SLAN96、ABI7500、ABI7300 plus、QuantStudio 3、QuantStudio 5、Biorad CFX-96等荧光定量PCR仪。

6. 【样本准备】   

1、适用样本类型：血清、血浆、口鼻拭子、组织样（脾、肺，淋巴结等）、环境样。

2、样品采集

（1）血清：用一次性无菌注射器采取5 mL静脉血，收集于无菌离心管中，室温放置不超过4h，待样本自行析出血清，或直接1600 rpm离心5min，吸取上清（注意勿吸入红细胞）转入无菌离心管中备用。

（2）血浆：用一次性无菌注射器采取5mL静脉血于含有EDTA或枸橼酸钠作为抗凝剂的无菌离心管中，立即轻轻颠倒混匀，室温放置不超过4h，待样本自行析出血浆，或直接1600 rpm离心5min，吸取上清转入无菌离心管中备用。

（3）鼻拭子：将带有聚丙烯纤维头拭子轻轻插入鼻道内，停留片刻后缓慢转动退出，将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。

（4）口拭子：将带有聚丙烯纤维头拭子给动物咀嚼，将拭子头浸入采样液中，尾部弃去。

（5）组织样：解剖，无菌采集的脾、肺、肾、扁桃体、淋巴结等组织样品。

（6）环境样：收集与病猪相关场所的粪便、饲料、污水样品。

3、样本存放和运送：

待测样本在2～8℃保存不应超过48h；-20±5℃保存不超过5个月；-70℃以下长期保存，应避免反复多次冻融。 样本运输应采用泡沫盒加冰袋密封运输。

4、样品处理方法

（1）血浆、血清、口鼻拭子、污水样：置于60℃条件下灭活30min后进行核酸提取。

（2）脾、肺、肾等组织样：取适当大小的组织块放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，70 Hz震荡研磨60s，制成约10%的组织匀浆液，5000 rpm离心5min，置于60℃条件下灭活30min后，取上清液进行核酸提取。

（3）粪便、饲料样：取适量的粪便、饲料放入盛有PBS缓冲液的研磨管中，70 Hz震荡研磨60s，制成约10%的匀浆液，5000 rpm离心5min，置于60℃条件下灭活30min后取上清液进行核酸提取。

7. 【操作步骤】

注：阳性对照和阴性对照不需要进行核酸提取！

1、试剂准备（试剂准备区）

取出试剂盒中的各组分，室温放置，待其温度平衡至室温后，充分融化混匀并瞬时离心以去除管壁附着液体；取N个（N=待测样本数量+阴性对照+阳性对照+误差预留量）PCR反应管，根据下表配制扩增体系。

在无菌离心管中加入上述试剂，充分混匀后瞬时离心，按照20 μL/管分装量将试剂分装至PCR反应管，盖上盖子瞬时离心并转移至样本处理区备用。

2、样本提取（样本处理区）

将待测样品进行核酸提取，具体操作按照核酸提取试剂盒说明书操作。

3、 加样（样本处理区）

向含有PCR反应液的反应管中（PCR反应管需置于冷冻冰盒上），分别加入提取的待测样本、阴性对照、阳性对照各5μL，盖紧管盖轻轻混合，瞬时离心后将PCR反应管转移至检测区。

4、PCR扩增（检测区）

（1）取样本处理区准备好的PCR反应管，放置在实时荧光定量PCR仪样品槽相应位置，并记录放置顺序。

（2）按下表设置仪器核酸扩增相关参数进行PCR扩增，FAM通道采集荧光信号，设置循环条件如下：

设置完成后，保存文件，运行程序。

8. 【质量控制】

      试剂盒提供阳性对照和阴性对照，同一次实验必须同时满足下表要求，否则，实验无效，需重新进行。

9. 【阳性判断值】

10. 【检验结果的解释】

（1）阴性：检测结果无Ct值；

（2）阳性：扩增曲线呈典型S型且Ct≤42；

（3）不确定：扩增曲线呈典型S型且42<Ct<45，判定为不确定样本，需重新提取核酸后进行检测，若复检样本扩增曲线呈典型S型且42<Ct<45，判定为核酸阳性，否则判定为阴性。

（5）结果判读：待测样本的靶基因的检测结果为阳性，同时阳性对照和阴性对照符合上述标准，即可判断为病毒核酸检测为阳性。

11. 【检测方法的局限性】

（1）本试剂盒仅供科研使用，使用前请详细阅读说明书；

（2）本试剂盒仅用于辅助诊断，不作为诊断检测的唯一依据，应结合病猪的发病症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑；

（2）有关假阴性结果的可能性分析

样本检测结果与样本收集、处理、运送及保存质量有关，其中任何失误都将会导致结果不准确。如果样本处理时没有控制好交叉污染，可能出现假阳性结果。

12. 【注意事项】

（1）本试剂盒仅用于科研使用，使用前请仔细阅读本说明书。

（2）试验前请熟悉和掌握需使用仪器的操作方法和注意事项，对每次实验进行质量控制。

（3）实验室管理应严格按照PCR基因扩增实验室的管理规范，实验人员必须进行专业培训；实验过程严格分区进行，所用消耗品应灭菌后一次性使用，实验操作的每个阶段使用专用的仪器和设备，各区各阶段用品不能交叉使用。

（4）所有检测样品应视为具有传染性物质，实验过程中穿工作服，戴一次性手套并经常替换手套以及避免样品间的交叉污染；样本操作、废弃物处理均需符合相关法规要求。

（5）所有的试剂在使用前，均需在室温下充分融化、混匀后使用。

（6）实验中用过的枪头请直接打入盛有10%次氯酸钠的废物缸内，并与其他废弃物品一同丢弃。工作台及各种实验用物品经常用10%次氯酸钠、75%酒精和紫外灯进行消毒。

13. 【储存条件】 -20℃   1年。